依维莫司(Everolimus)和二甲双胍治疗乳腺癌细胞具有协同作用

　　在许多实验系统中，依维莫司（Everolimus）抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白 (mTOR) 并导致蛋白质合成减少和癌细胞增殖减少。腺苷 5'-单磷酸活化蛋白激酶 (AMPK) 激活剂，如二甲双胍，与将 AMPK 激活与 mTOR 抑制联系起来的 TSC2/1 通路具有相似的作用。乳腺癌的组织病理学和生化研究显示 AMPK 和 mTOR 通路经常失调。因此，我们研究了 mTOR 抑制剂依维莫司和二甲双胍治疗乳腺癌细胞的疗效。本研究评估了依维莫司单独或与二甲双胍联合对乳腺癌细胞的体外和体内作用。MTT法用于量化药物对体外乳腺癌细胞的抑制作用。用注射了 HCC1428 细胞的 SCID 小鼠进行了不同的治疗，以评估不同药物的体内功效。数据显示，依维莫司和二甲双胍的组合对培养和小鼠异种移植模型中的乳腺癌细胞的生长具有协同抑制作用。此外，这种组合消除了 S6 和 4EBP1 磷酸化。总的来说，我们建议依维莫司和二甲双胍的组合可能是治疗乳腺癌的有效方案，因此需要在临床上进一步评估该组合。

　　来自临床前研究的累积证据表明，二甲双胍对肿瘤疾病的临床过程，特别是对乳腺癌的临床过程发挥积极作用，主要是通过刺激与上游肝激酶 B1 (LKB1) 相关的 AMPK。AMPK 是一种关键的细胞能量传感器，二甲双胍对其的激活会抑制能量消耗过程，例如糖异生、蛋白质和脂肪酸合成，并且在 2 型糖尿病患者中，会导致高血糖和胰岛素抵抗的代谢正常化。在癌细胞中，由二甲双胍介导的 AMPK 刺激导致抑制 mTOR/核糖体 S6 激酶途径，从而抑制病理性细胞周期进程、细胞生长和血管生成。同样，二甲双胍对 AMPK 的刺激会显着抑制雌激素受体 α (ERα) 阴性和阳性人乳腺癌细胞系中的细胞增殖。

　　磷脂酰肌醇 3-激酶 (PI3K)/蛋白激酶 B (AKT)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白 (mTOR) 活性的失调在乳腺癌中经常发生。依维莫司或其类似物对 mTOR 活性的抑制导致细胞周期进程、存活和抗凋亡所需的蛋白质的翻译抑制，从而在体外和体内抑制乳腺肿瘤的生长和进展。然而，依维莫司作为单一药物在实体瘤中的活性是有限的。依维莫司有限的临床益处可能与抑制 PI3K/AKT 活性的 mTOR 依赖性反馈回路有关。依维莫司（Everolimus）通过抑制 mTOR，不仅抑制蛋白质翻译，而且抑制这个反馈回路，导致 AKT 活化增加。这反过来可能会限制这类药剂的一些抗增殖作用。最近公布的数据表明，通过 AMPK 激活二甲双胍暴露导致的 mTOR 抑制降低了 AKT 激活，这一作用与依维莫司的作用相反。这些发现表明，通过将二甲双胍与依维莫司联合化疗药物的治疗方案结合，抗肿瘤疗效可能会进一步增强。

　　这项研究首次证明依维莫司（Everolimus）与二甲双胍联合使用可在体外和体内抑制乳腺癌细胞的生长。在以前的研究中，干细胞被认为对抗肿瘤药物具有抗药性。抗肿瘤药物会杀死占肿瘤内大部分细胞的分化细胞，但不影响少数干细胞。在本研究中，我们还发现，与单独用药相比，依维莫司和二甲双胍联合用药对乳腺CSCs有显着抑制作用。

　　首先，我们研究了依维莫司（Everolimus）和二甲双胍对乳腺癌细胞系的体外抗癌作用，结果表明依维莫司（Everolimus）或二甲双胍可抑制不同乳腺癌细胞系的增殖，包括 HCC1428、MDA-MB-468 和 BT549 细胞系。浓度依赖性方式。然后，我们在一组乳腺癌细胞系中研究了依维莫司和二甲双胍对肿瘤细胞增殖的组合作用。令我们惊讶的是，当在二甲双胍治疗方案中加入依维莫司时，细胞增殖抑制作用进一步增强。由于依维莫司和二甲双胍组合在体外对乳腺癌细胞具有良好的生长抑制作用，我们还验证了该组合对小鼠乳腺癌肿瘤生长的功效。依维莫司和二甲双胍的组合显着抑制了 HCC1428 异种移植物的生长，而单独使用依维莫司或二甲双胍在测试剂量下仅最小或部分抑制 HCC1428 异种移植物的生长，通过肿瘤大小和重量测量。此外，该组合在抑制异种移植物的生长方面明显比每种单一药物更有效（p < 0.01 与依维莫司或二甲双胍组相比）。这些体外和体内数据进一步证明依维莫司和二甲双胍的组合显示出增强的抗癌活性。

　　以前的研究已经确定了 CSC 在乳腺癌生长、侵袭、转移和化疗耐药中的关键作用。因此，我们评估了依维莫司与二甲双胍联合是否可以显着抑制乳腺 CSC。我们进行了乳腺球形成试验以确定依维莫司和二甲双胍是否可以协同抑制乳腺癌细胞的干性。结果表明，对照组HCC1428细胞产生更多更大的球体。依维莫司和二甲双胍的组合显着抑制了 HCC1428 乳腺球的生长，而单独的依维莫司或二甲双胍在测试剂量下仅最小或部分抑制了 HCC1428 乳腺球的生长。此外，与单独的依维莫司或二甲双胍组相比，依维莫司+二甲双胍组的联合治疗观察到显着更大的CD44+/CD24-细胞抑制作用。

　　为了了解依维莫司（Everolimus）和二甲双胍组合发挥增强抗癌活性的机制，我们分析了组合对 S6 和 4EBP-1 磷酸化的影响，它们是翻译抑制因子，当被 mTOR 磷酸化时其作用减弱。依维莫司或二甲双胍单独降低 HCC1428 细胞系中 p-S6 和 p-4EBP-1 的水平。与单独的依维莫司或二甲双胍相比，在依维莫司 + 二甲双胍细胞中观察到 p-S6 和 p-4EBP-1 的水平显着降低。此外，我们发现单独使用依维莫司或二甲双胍可部分降低 p-S6 和 p-4EBP-1 水平。然而，它们的组合在降低异种移植肿瘤中 p-S6 和 p-4EBP-1 水平方面比任何一种单一药物都更有效，这表明依维莫司和二甲双胍的组合对 S6 和 4EBP-1 磷酸化的抑制也有增强作用体内。我们的研究结果表明，这种组合可以为乳腺癌治疗提供新的策略。这种效果可能与序列有关，

　　综上所述，本研究的体内和体外结果表明，依维莫司（Everolimus）和二甲双胍联合用药可以在一定程度上增强各单药对乳腺癌细胞的抑制作用。这种组合为乳腺癌患者提供了一种新的治疗选择。然而，这些药物的联合作用仍需要大规模的临床试验进一步验证。

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