帕纳替尼(ponatinib)对FGFR2突变子宫内膜癌细胞的抗肿瘤作用

　　FGFR2 的异常突变激活与子宫内膜癌 (EC) 相关。目前正在进行临床试验的帕纳替尼（ponatinib）已知是一种可口服的多靶点酪氨酸激酶抑制剂。我们的生化激酶测定表明，帕纳替尼（ponatinib） 对野生型 FGFR1-4 和 5 个突变型 FGFR（V561M-FGFR1、N549H-FGFR2、K650E-FGFR3、G697C-FGFR3、N535K-FGFR4）具有最强的激酶抑制活性N549H-FGFR2 (IC500.5 nM) 在所有测试的 FGFR 中。因此，我们研究了帕纳替尼对具有激活 FGFR2 突变的子宫内膜癌细胞的影响，并探索了潜在的分子机制。帕纳替尼显着抑制具有激活 FGFR2 突变（N549K、K310R/N549K、S252W）的子宫内膜癌细胞的增殖，主要诱导 G1/S 细胞周期停滞导致细胞凋亡。帕纳替尼还降低了源自 MFE-296 和 MFE-280 细胞的免疫沉淀 FGFR2 的激酶活性，并降低了 MFE-296 和 AN3CA 细胞上 FGFR2 和 FRS2 的磷酸化。帕纳替尼导致带有 FGFR2 激活突变的 EC 上的 ERK 磷酸化、PLCγ 信号传导和 STAT5 信号转导显着降低。Akt 信号通路也被帕纳替尼灭活。帕纳替尼主要通过阻断 ECs 上的 ERK、PLCγ 和 STAT5 信号转导发挥化疗作用。此外，帕纳替尼抑制具有 FGFR2 突变的子宫内膜癌细胞的迁移和侵袭。此外，帕纳替尼显着阻断了子宫内膜癌细胞的不依赖锚定的生长。我们首次报告了帕纳替尼对具有 FGFR2 激活突变的 ECs 发挥抗肿瘤作用的分子机制，这将为帕纳替尼对 ECs 的持续临床研究提供机制见解。

　　多种人类肿瘤，如多发性骨髓瘤、乳腺癌、前列腺癌、结肠癌和子宫内膜癌，都与 FGFR 的激活突变和过表达有关。特别是，已知 FGFR2 的激活突变与约 16% 的子宫内膜癌相关。据报道，子宫内膜样子宫内膜癌的FGFR2表达高于非子宫内膜样癌。作者认为 FGFR2 在子宫内膜中具有双重功能。在正常子宫内膜中，FGFR2可以抑制月经周期的细胞增殖，但在子宫内膜癌中被视为癌基因。使用 shRNA 载体和小分子 pan-FGFR 抑制剂（如 PD173074）敲低 FGFR2 导致子宫内膜癌细胞的细胞周期停滞和细胞死亡。针对 EGFR、VEGFR 和 AKT/mTOR 信号通路的临床评估已针对子宫内膜癌进行。然而，到目前为止，这些靶向疗法的效果并不显着和最终。激活 FGFR2 突变可能是子宫内膜癌的重要治疗靶点。其他几项研究试图阐明帕纳替尼（ponatinib）在体外和体内的抗肿瘤作用。例如，ponatinib 可抑制携带多维替尼耐药 FGFR2 突变的 Ba/F3 细胞的增殖。此外，SNU16（胃癌）、UMUC14（肾癌）和 AN3CA 细胞的皮下异种移植模型被证明通过下调 FGFR 和 FRS2 磷酸化来抑制肿瘤生长。此外，通过联合口服治疗帕纳替尼和 ridaforolimus 在裸鼠中抑制 FGFR2 和 mTOR 活性，在子宫内膜癌异种移植模型中发挥协同抗肿瘤作用。

　　目前正在进行临床试验的 帕纳替尼（ponatinib）是一种有效的多靶点激酶抑制剂。在这项研究中，我们研究了帕纳替尼（ponatinib）对具有激活 FGFR2 突变的子宫内膜癌细胞的抗肿瘤作用和机制。我们的生化激酶测定数据显示，帕纳替尼（ponatinib）对野生型 FGFR1-4 和 5 个突变型 FGFR（V561M-FGFR1、N549H-FGFR2、K650E-FGFR3、G697C-FGFR3、N535K-FGFR4）具有最强的激酶抑制活性在所有测试的 FGFR 中，N549H-FGFR2（IC50为 0.5 nM）。据报道，FGFR1-V561M 是对应于 Abl-T315I 和 EGFR-T766M 突变体的看门人突变体，可赋予对 FGFR 抑制剂包括 PD173074 的抗性。FGFR2 中的 N549H 突变与 Crouzon 综合征相关这种突变通过松开激酶铰链区的分子制动器以不依赖配体的方式激活激酶。另外值得注意的是，帕纳替尼对 FGFR4-N535K 突变体的 IC50值为 2.44 nM，而 PD173074 对该突变体无活性。然后，我们研究了帕纳替尼和 PD173074 对带有 FGFR2 激活突变的 MFE-296 (N549K)、AN3CA (K310R/N549K) 和 MFE-280 (S252W) 子宫内膜癌细胞的细胞影响。MFE-296、AN3CA 和 MFE-280 细胞对帕纳替尼和 PD173074 比具有野生型 FGFR2 的 Ishikawa 细胞系更敏感。帕纳替尼（ponatinib）比 PD173074 更强烈地抑制这些子宫内膜癌细胞系的生长。FACS分析显示帕纳替尼（ponatinib）主要诱导G1/S细胞周期阻滞，导致MFE-296和AN3CA细胞凋亡。

　　低浓度 (0.1 μM) 的帕纳替尼（ponatinib）显着抑制了具有 FGFR2 激活突变的子宫内膜癌细胞中的 FGFR2 激酶活性以及 FGFR 和 FRS2α 的磷酸化。此外，帕纳替尼（ponatinib）明显降低了 ERK 和 Akt 的磷酸化。在 MFE-296 和 AN3CA 细胞中。相比之下，PD173074 不影响 Akt 在 MFE-296 和 AN3CA 细胞系中的激活，这与 Byron等人的报道一致。在测试的 FGFR2 失调的子宫内膜癌细胞中， 1携带 FGFR2 双突变（K310R 和 N549K）的 AN3CA 细胞对帕纳替尼最敏感。AN3CA 细胞也对 PD173074 敏感，这与之前的报告一致，尽管 AN3CA 细胞对 PD173074 的敏感性低于对 帕纳替尼 的敏感性。我们发现帕纳替尼对具有激活 FGFR2 突变的子宫内膜癌细胞中 PLCγ-PKCα 的激活以及 STAT5 磷酸化具有抑制作用。帕纳替尼（ponatinib）对 FGFR2 下游信号传导的减弱解释了其对子宫内膜癌细胞的抑制迁移作用。

　　据报道，FGFRs 参与各种细胞过程，例如细胞凋亡、增殖、迁移和血管生成。抑制胶质瘤 C6 细胞中的 FGFR1 和 FGFR2 活性与减少肿瘤血管形成以及 VEGF 的表达有关。我们观察到帕纳替尼（ponatinib）能够抑制 MFE-296 和 AN3CA 细胞的迁移和侵袭。这些发现表明，FGFR2 将成为抑制具有 FGFR2 激活突变的子宫内膜癌细胞迁移和/或侵袭能力的有效靶标。综上所述，这无疑是帕纳替尼（ponatinib）对FGFR2失调的子宫内膜癌细胞具有优异的抑制能力。此外，帕纳替尼对具有激活FGFR2突变的子宫内膜癌细胞的抗肿瘤作用可能主要与阻断ERK、PLCγ和STAT5信号转导有关。

　　我们首次展示了帕纳替尼（ponatinib）对具有激活 FGFR2 突变的 EC 发挥抗肿瘤作用的分子机制，这将为帕纳替尼（ponatinib）用于 EC 的正在进行的临床试验提供机制见解。

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