TAF在分泌性碱性磷酸酶中的分析

　　使用Gene Juice（Novagen），根据制造商的方案，用pU6-puro-siTAF-1或pU6-puro-siEGFP以及含有ISRE和pSEAP-Control（Clontech）的pISRE-TA-Luc（Clontech）转染HEK293细胞。转染后48小时，将细胞用或不用IFN-β（1000 IU / ml）处理6小时。使用萤光素酶测定系统（Promega）和MiniLumat LB9506发光计（Berthhold），将细胞裂解液用于萤光素酶活性的测定。

　　为了监测转染效率，使用SEAP分析试剂盒（Toyobo）对每种细胞培养基的一部分进行了分泌性碱性磷酸酶（SEAP）的分析。为了研究TAF在ISG转录中的作用，我们首先研究了TAF的作用-我在ISG转录上KD。 TAF由两个亚型TAF-1α和TAFβ组成。它们具有共同的结构，除了TAFα的37个氨基酸（aa）氨基末端区域不同于TAF-Iβ的24个氨基酸的氨基末端区域。在TAFKD细胞中（参见材料和方法部分），TAF蛋白的水平约为对照细胞的25％。为了检查TAF的减少对ISGs转录诱导的影响，从细胞中分离总RNA，并用针对ISG mRNA的特异性引物组进行qRT-PCR。

　　在TAFKD细胞中，IFN刺激诱导的ISG mRNA水平显着高于对照细胞。我们还观察到在用siRNA转染针对TAF-1的其他TAFKD细胞中具有相同的效果，其靶向的TAF-1区域不同于用于分析的TAF的表达siRNA的载体，用于图中的分析。注意，不仅在IFN刺激的条件下而且在未刺激的条件下都观察到了TAF-1KD细胞中ISG mRNA的增加。动力学分析表明，在IFN诱导后的早期阶段，TAFKD细胞中ISG15mRNA和ISG15pre-mRNA的水平显着高于未刺激的细胞中的ISG15 mRNA和ISG15pre-mRNA的水平。其他ISG的mRNA水平也以时间依赖的方式显示出相似的作用。这些结果表明，TAF负调节ISG的转录，并暗示TAF-1可能参与了ISG的转录沉默状态的维持。为了阐明TAF-1在转录调节中的作用，我们研究了TAF的作用。 I在IFN信号传导途径上导致转录激活。 IFN刺激JAK-STAT通路并诱导STAT1和STAT2磷酸化，导致STAT1-STAT2异二聚体与IRF9一起形成ISGF3复合物。

　　ISGF3复合物与ISG启动子附近的ISRE结合，促进转录起始复合物的形成，从而促进ISG的转录。 STAT1-STAT2异二聚化和ISGF3复合物的形成需要STAT2在酪氨酸690处的磷酸化和STAT1在酪氨酸701处的磷酸化，此外，STAT1在丝氨酸727处的磷酸化还刺激了ISG转录的激活。为了检查TAF-1是否影响STATs的磷酸化状态，我们使用了对每种磷酸化STAT特异的抗体进行了蛋白质印迹分析。 TAFKD与对照细胞之间的酪氨酸磷酸化STAT1和STAT2，丝氨酸磷酸化STAT1或和IRF9的含量无显着差异，表明TAF-我不影响IFN诱导的STAT激活级联反应。现在taf哪能买到？价格是多少？详情可咨询下方微信。