格列卫/伊马替尼对分化精原细胞具有有害作用

　　格列卫/伊马替尼是越来越多提供分子靶向治疗的有效抗癌药物之一。然而，伊马替尼会导致啮齿动物的生殖缺陷。体外的可用性筛选药物对精子发生影响的系统将是有益的。伊马替尼靶点、KIT 和血小板衍生生长因子受体 β (PDGFRB) 在此处显示在含有精原细胞的“生殖干”(GS) 细胞培养物中表达，包括精原干细胞 (SSC)。GS 细胞培养物用于确定伊马替尼是否影响 SSC 自我更新或分化。在伊马替尼中生长的 GS 细胞基于多种检测（包括移植）保留了自我更新。然而，伊马替尼的生长导致分化精原细胞数量减少和培养物生长减少，这与已知的 KIT 对精原细胞存活和增殖的要求一致。这些结果建立在体内研究并支持利用 GS 细胞培养物进行临床前药物测试的可能性。

　　在本研究中，我们表明格列卫/伊马替尼可减少分化细胞数量和总体 GS 细胞培养生长。重要的是，精原干细胞自我更新不受伊马替尼治疗的影响。对 GS 细胞培养物的影响可能是通过抑制分化精原细胞中的 KIT 活性来介导的，这代表了异质 GS 细胞群的很大一部分。我们的结果与评估伊马替尼对啮齿动物生殖生理学影响的体内研究一致，这一事实支持将 GS 细胞培养系统包括在临床前体外药物测试模型中的可能性。

　　格列卫/伊马替尼治疗是 CML 和 GIST 的一线治疗。如果 KIT 或 PDGFR 的激活被证明是分子原因，则其他类型的癌症也可能用伊马替尼治疗。此外，虽然伊马替尼治疗主要用于成人患者，但儿科患者群体正在不断扩大。尽管如此，尽管精原细胞在维持生育力方面很重要，但尚未评估伊马替尼直接对精原细胞的影响。三项研究均侧重于产前期，评估了伊马替尼对啮齿动物雄性生殖系统的影响。巴夏尼等人在生命的前五天，每八小时将伊马替尼注射到新生小鼠体内。在出生后第 5-7 天或仅在第 5 天将伊马替尼注射到大鼠体内。在啮齿动物中，出生后生殖细胞发育的主要特征是生殖细胞从曲细精管中心迁移到基底膜，伊马替尼治疗基本上抑制了这一过程。由于生殖细胞迁移是建立未分化精原细胞/SSC 池和精原细胞分化的必要先决条件，因此后来也观察到的影响，例如精原细胞数量的减少，可能是继发于不完整的影响。性腺细胞迁移。考虑到人类生殖细胞迁移大多在出生时完成，伊马替尼对 SSCs 和精原细胞的影响，

　　我们提供了确凿的证据表明格列卫/伊马替尼不会阻碍 SSC 的自我更新。首先，GS 细胞可以在 1 μM 伊马替尼存在的情况下通过多次传代维持一个多月。其次，伊马替尼处理的 GS 细胞能够在移植后以与未处理的 GS 细胞相似的速率进行体内定植。第三，伊马替尼处理和未处理的 GS 细胞在体外产生了相似的簇数簇形成测定。这些结果与将 KIT 表达和功能与分化的精原细胞而不是与 SSC 联系起来的现有数据一致。小鼠研究也表明伊马替尼治疗不会对自我更新产生不利影响，因为没有观察到对生精小管组织学和精子产生的长期（120 天）影响 。尽管如此，如上所述，格列卫/伊马替尼治疗是在精原细胞形成之前的产后阶段，可能无法与青春期男性患者的伊马替尼治疗相媲美。总之，我们的数据与体内一致数据表明 SSC 自我更新不受伊马替尼的影响，并通过直接证明 SSC 自我更新对伊马替尼的不渗透性来建立以前的研究。

　　尽管 SSC 自我更新不受格列卫/伊马替尼的影响，但观察到 GS 细胞培养生长的短暂减少。也就是说，在 GS 细胞在含有伊马替尼的培养基中生长超过一周后，与对照相比，可见更少的细胞和更小的细胞簇。我们还观察到 SOHLH1 阳性和 KIT 阳性分化精原细胞的频率降低。然而，这种减少不太可能是由分化过程中的抑制引起的，因为格列卫/伊马替尼不影响 RA 诱导的分化。相反，GS 细胞培养物中分化精原细胞的减少可能是由于 GS 细胞在培养中维持而产生的分化精原细胞存活率降低的结果。有趣的是，我们发现在正常 GS 细胞培养物中，较高水平的 KIT 表达与较大的簇大小和较高的细胞密度相关，这些条件通常在传代后保持较长时间的培养物中发现。其他人最近也报道了 GS 细胞中 KIT 表达和细胞密度之间的相关性，尽管在无饲养层粘连蛋白培养系统的背景下，KIT 阳性细胞也保留了干细胞活性。我们的数据建议使用以下模型来描述 GS 细胞的动态和异质性。SSC 增殖导致产生新的 SSC（KIT 阴性，伊马替尼耐药）和分化精原细胞（KIT 阳性，伊马替尼敏感）。随着培养物在没有传代和簇大小增加的情况下保持，分化水平（KIT 表达）增加；然而，在伊马替尼存在的情况下，产生的分化细胞的生存能力降低，从而限制了培养物的整体生长和分化状态。尽管如此，GS 细胞培养可以在伊马替尼存在的情况下持续维持，因为 SSC 自我更新不受伊马替尼的影响。我们赞成观察到的格列卫/伊马替尼作用由 KIT 介导的观点，但并未排除 PDGFR 信号传导在 GS 细胞培养物中的作用。然而，在睾丸中，生殖母细胞中的 PDGFRB 活性受到支持细胞分泌 PDGF 配体的刺激；相反，在 GS 细胞培养物中，表达 PDGFRB 的生殖细胞极为罕见。

　　近年来，国家研究委员会概述了其对更精细的毒性测试方法的愿景，该方法应更多地利用细胞模型系统并利用最新技术，如高通量筛选。此外，减少对动物毒性和药物测试的依赖显然是有益的。一个理想的体外细胞系统可以捕捉到它所模拟的体内发育过程的许多特征。事实上，GS 细胞表现出精原细胞的多种特征，它们在体内对应物：大量蛋白质标志物的表达、胞质分裂不完全的细胞分裂以及对视黄酸的分化反应等。重要的是，GS 细胞被证明含有功能性 SSC，因为它们具有在移植后体内定殖、自我更新和产生功能性精子的能力，这是 GS 细胞与其他精原细胞培养系统的区别。此外，GS 细胞不是通过添加转化转基因而人为地永生化。尽管如此，GS 细胞作为临床前评估药物对生殖细胞影响的模型系统的效用才刚刚开始评估。随着靶向分子途径的新药不断出现，这些分子途径不仅在癌细胞中失调，而且在正常细胞中也是生理功能所必需的，“脱靶”影响精子发生的可能性是非常真实的。

　　我们在此说明了 GS 细胞培养系统在检查广泛使用的抗癌药物格列卫/伊马替尼对精子发生创始细胞的影响方面的价值。使用这种体外系统，我们可以评估精原干细胞的自我更新和分化。我们的结果与体内数据一致，这些数据表明对生育能力、精子产生和睾丸重量有短暂但显着的有害影响。此外，最近报道了一种基于成像的方法，用于评估大鼠 GS 细胞中的细胞毒性，该方法适用于高通量筛选。他们的研究评估了顺铂等化疗药物的效果，与我们的研究一起开始建立 GS 细胞培养系统作为动物的重要替代品，用于测试药物对精子发生早期阶段的影响。

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