易瑞沙/吉非替尼和地西他滨在结肠癌细胞中的协同抗癌活性

　　尽管近来在人类结肠癌的治疗方面取得了进展，但针对结肠癌的化学疗法疗效仍不能令人满意。在本研究中，在人结肠癌细胞中检查了同时抑制表皮生长因子受体 (EGFR) 和 DNA 甲基转移酶的效果。我们证明地西他滨（一种 DNA 甲基转移酶抑制剂）与易瑞沙/吉非替尼（一种 EGFR 抑制剂）协同降低 SW1116 和 LOVO 细胞中的细胞活力和集落形成。然而，这两种化合物的组合对正常人结肠粘膜上皮细胞系 NCM460 细胞的毒性很小。该组合在抑制 AKT/mTOR/S6 激酶途径方面也更有效。此外，地西他滨与吉非替尼联用显着抑制结肠癌细胞迁移。此外，吉非替尼协同增强地西他滨诱导的细胞毒性主要是由于细胞凋亡，如膜联蛋白 V 标记所示，被泛半胱天冬酶抑制剂 z-VAD-fmk 减弱。同时，与单独使用任一药物治疗相比，易瑞沙/吉非替尼和地西他滨共同治疗导致的细胞凋亡伴随着 BAX、切割的半胱天冬酶 3 和切割的 PARP 的诱导，以及 Bcl-2 的减少。有趣的是，这两种药物的联合治疗增加了在细胞凋亡中起重要作用的 XIAP 相关因子 1 (XAF1) 的表达。此外，XAF1 的小干扰 RNA (siRNA) 消耗显着减弱了两种药物联合诱导的结肠癌细胞凋亡。我们的研究结果表明，吉非替尼联合地西他滨在结肠癌细胞中发挥增强的细胞凋亡作用，这与线粒体介导的途径和 XAF1 表达的诱导有关。总之，根据我们研究的观察结果，我们建议这两种药物的联合给药可能被认为是治疗结肠癌的一种新的治疗方案。

　　对靶向 EGFR 的化疗药物进行了多项研究，从而减弱结肠癌中的 EGFR 信号通路。然而，除非 EGFR 靶向治疗与其他化疗药物联合使用，否则单一 EGFR 抑制剂的反应效果仍然相对温和。与之前的研究结果一致，我们发现单独使用 EGFR 抑制剂易瑞沙/吉非替尼会适度降低携带野生型EGFR基因的 SW1116 和 PC-9 结肠癌细胞系的细胞活力，DNA甲基转移酶抑制剂作为有前途的抗肿瘤药物已被证明可以去甲基化和上调肿瘤抑制基因的表达，并在体外、体内和临床中显示出强大的抗肿瘤生长作用。尽管 DNA 去甲基化剂诱导的细胞凋亡本身是最小的，但它们具有增强其他化学治疗剂（例如 DNA 损伤剂顺铂）的作用的潜力。

　　在目前的研究中，地西他滨联合易瑞沙/吉非替尼在抑制结肠癌细胞中的细胞活力方面比单药更有效。组合指数数据分析表明，该组合对抑制结肠癌细胞的细胞活力具有高度协同作用。克隆形成测定结果显示，联合疗法处理的细胞中阳性菌落数量显着减少，表明治疗相互作用造成的损害是慢性的，受影响的细胞无法恢复。此外，Annexin V 测定表明，地西他滨加吉非替尼的组合在诱导结肠癌细胞凋亡方面具有协同作用。这些结果提出了地西他滨和吉非替尼的组合在结肠癌细胞中发挥双重抗癌作用的可能性，这包括细胞凋亡诱导加细胞周期阻断。此外，该组合在抑制结肠癌细胞迁移方面具有协同作用。更重要的是，地西他滨和吉非替尼的组合对正常人结肠粘膜上皮细胞系 NCM460 细胞的毒性最小。上面显示的数据表明了一种在人结肠癌中使用地西他滨和吉非替尼组合的新治疗策略。

　　我们的结果表明，易瑞沙/吉非替尼抑制了 AKT/mTOR 通路的主要介质 p-AKT、p-mTOR 和 p-S6K 的表达。此外，地西他滨和吉非替尼联合治疗比单独使用单一药物更能降低 p-AKT、p-mTOR 和 p-S6K 的表达，表明 AKT/mTOR 通路的协同抑制。已经表明，AKT/mTOR 通路对于细胞存活和抗凋亡至关重要。因此，两种药物联合诱导的细胞凋亡和细胞存活抑制可能与抑制 AKT/mTOR 通路有关。AKT 已被证明直接与 XIAP 相互作用并使其磷酸化，被 AKT 磷酸化的 XIAP 可以防止 XIAP 降解，从而抑制 caspase 3 的活化，从而抵抗细胞凋亡。因此，我们检测了两种药物单独或联合处理的结肠癌细胞中 XIAP 的表达。出乎意料的是，我们没有检测到两种化合物联合处理的结肠癌细胞中 XIAP 表达的明显降低。对我们的结果与先前研究的差异的一种可能解释可能是由于 XIAP 和 AKT 之间的相互作用存在于特定组织学类型的癌症或细胞系特定途径中。

　　多项研究表明，结肠癌细胞中的细胞周期调节基因CDKN2A是高甲基化的，而地西他滨诱导的细胞增殖抑制可能是由于CDKN2A基因甲基化沉默的释放引起的。此外，先前的研究表明XAF1基因的等位基因缺失在癌细胞系中很普遍。相比之下，XIAP 水平在大多数癌细胞系中相对较高。研究表明，癌细胞中高水平的 XIAP to XAF1 表达可能通过 XIAP 抗凋亡功能的相对增加来提供生存优势。此外，在许多结肠癌中，XAF1基因的 CpG 岛被高甲基化，导致转录抑制。在本研究中，DNA去甲基化剂地西他滨在SW1116和LOVO细胞中诱导了XAF1的表达，提出了地西他滨通过阻止XAF1基因的CpG岛甲基化来增加XAF1水平的可能性。更重要的是，与单药治疗相比，两种药物联合治疗的结肠癌细胞中 XAF1 mRNA 和蛋白质水平的表达均显着增加。已知易瑞沙/吉非替尼可抑制 ABC 家族的跨膜转运蛋白，包括 P-gp、MRP1 和 BCRP。这提出了一种可能性，即易瑞沙/吉非替尼增加了地西他滨的细胞积累，这与其通过增强 CDKN2A 表达抑制细胞增殖的能力相关，并通过上调 XAF1 水平诱导细胞凋亡。

　　值得注意的是，仅易瑞沙/吉非替尼在结肠癌细胞中适度上调了 XAF1 的表达，这提出了 XAF1 上调的另一个可能的解释是吉非替尼也靶向表观遗传途径。需要进一步研究以研究地西他滨和吉非替尼单独或联合诱导XAF1的机制。为了询问地西他滨与吉非替尼联合诱导细胞凋亡是否与 XAF1 有关，通过在结肠癌细胞中使用 siRNA 耗尽了 XAF1。我们发现，siRNA 对 XAF1 的消耗减弱了地西他滨与吉非替尼联合诱导的结肠癌细胞凋亡。这些结果表明 XAF1 有助于两种药物联合触发的细胞凋亡。

　　在这项研究中，我们展示了地西他滨和易瑞沙/吉非替尼在抑制结肠癌细胞生长、诱导细胞凋亡和抑制细胞迁移方面的协同作用。地西他滨与吉非替尼联用可部分通过抑制 AKT/mTOR 通路抑制细胞生长并诱导细胞凋亡。此外，我们的研究结果表明，线粒体介导和 XAF1 依赖性凋亡途径参与了地西他滨加吉非替尼诱导的结肠癌细胞细胞死亡。总之，这项研究提供了临床前证据，表明地西他滨和吉非替尼的组合可能是治疗结肠癌的一种新颖且有前景的治疗方法，值得在临床环境中进行进一步研究。

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