阿昔替尼(axitinib)在胶质瘤细胞系中诱导衰老相关细胞死亡和坏死

　　尽管有新的治疗进展，但胶质母细胞瘤与较差的总生存期有关。基于酪氨酸激酶抑制剂 (TKI) 的针对 VEGF 的抗血管生成策略目前正在进行广泛的胶质瘤治疗研究。在这里，我们证明了 TKI 阿昔替尼（axitinib）诱导 DNA 损伤反应 (DDR)，其特征是 γ-H2AX 磷酸化和 Chk1 激酶激活，导致 U87、T98 和 U251 胶质瘤细胞系中的 G2/M 细胞周期停滞和有丝分裂灾难。此外，我们发现 p21(Waf1/Cip1) 水平升高与 U87 和 T98 细胞系中 ROS 的诱导和衰老相关的细胞死亡相关，而 N-乙酰半胱氨酸预处理可逆转这些细胞死亡。相反，U251 细胞系对阿昔替尼治疗显示出耐药表型，这可以通过细胞周期停滞但没有细胞死亡迹象来证明。

　　阿昔替尼与其他疗法的联合使用，旨在抑制参与肿瘤生长的多种信号通路，可以提高这种 TKI 的效率。因此，我们研究了阿昔替尼与无毒性剂量的蛋白酶体抑制剂硼替佐米对 U87 和 T98 阿昔替尼敏感和阿昔替尼耐药的 U251 细胞系生长的综合影响。与单一治疗相比，联合暴露在抑制所有神经胶质瘤细胞系的细胞活力方面更有效，尽管细胞死亡方式不同。还在胶质瘤细胞系中研究了关键 DDR 和细胞周期蛋白的调节，包括 Chk1、γ-H2AX 和 p21(Waf1/Cip1)。

　　总的来说，这些发现为阿昔替尼（axitinib）联合硼替佐米克服胶质瘤的治疗耐药性提供了新的视角。

　　在这项研究中，我们描述了阿昔替尼（axitinib）治疗会影响诱导 DDR 的神经胶质瘤细胞活力。这种对基因毒性损伤的反应涉及通过一类蛋白激酶（包括 ATM、ATR）感知 DNA 损伤，然后激活导致暂时性细胞周期停滞的 Chk1 和 Chk2 激酶，并促进受损部位 DNA 修复复合物的组装在染色体。检查点调节剂 Chk1 和 p21 被发现可促进损伤诱导的有丝分裂灾难和衰老样表型。

　　在这里，我们发现用阿昔替尼（axitinib）治疗胶质瘤细胞会触发 DDR，这可以通过磷酸化 H2AX 和 Ser345-Chk1 水平的增加来证明，导致 G2/M 期的细胞周期停滞和多倍体胶质瘤细胞的积累，从而发生有丝分裂灾难。此外，在 U87 和 T98 细胞系中，在稍后的时间点，当 Ser-345-Chk1 活化下降时，细胞周期抑制剂 p21 的过表达会激活细胞衰老程序，导致与衰老相关的细胞死亡和处理细胞的坏死。相反，在 U251 阿昔替尼耐药细胞中观察到 G2/M 期的逐渐增加和治疗后 72 小时多倍体细胞的积累。

　　许多抗肿瘤药物，包括 DNA 损伤剂，可诱发有丝分裂灾难。特别是四倍体肿瘤细胞，本质上易受有丝分裂畸变的影响，对有丝分裂灾难的诱导很敏感。为了检测有丝分裂灾难的发生，使用了形态特征和有丝分裂缺陷的存在。最初，有丝分裂灾难被定义为由异常有丝分裂引起的细胞死亡相关过程。然而，现在已经证明，有丝分裂灾难代表了细胞凋亡或坏死之前的一步。在这方面，我们发现阿昔替尼在药物敏感的 U87 和 T98 以及耐药的 U251 胶质瘤细胞中均诱导有丝分裂灾难。事实上，所有经历有丝分裂灾难的神经胶质瘤细胞系都显示出多核化和增加的线粒体质量，但只有 U87 和 T98 细胞死亡。总的来说，我们的研究结果支持有丝分裂灾难代表衰老相关细胞死亡之前的一步的假设。

　　目前，两种不同类型的细胞衰老已在体内和体外得到证实。复制性衰老代表了增殖能力的稳定和长期丧失，尽管由于端粒损失或功能障碍和过早衰老（一种 DNA 损伤与衰老相关的细胞死亡）而导致的持续活力和代谢活动端粒缩短前的阶段。后一种衰老程序是由化学治疗剂、氧化应激、致癌或有丝分裂信号诱导的，尽管不同细胞系的 p53 状态不同，但会导致细胞活力降低和通过不同的细胞死亡方式诱导细胞死亡。事实上，我们证明了在阿昔替尼暴露后 p53 野生型 U87 细胞中 β-gal+PI+和 β-gal-PI+细胞的数量增加，这表明 p53 野生型 U87 细胞出现衰老相关坏死和坏死细胞死亡。在 p53 突变 T98 细胞系中，阿昔替尼处理的细胞显示 β-gal+PI+表型，这是衰老相关细胞死亡的迹象；在阿昔替尼处理的 p53 突变 U251 细胞中没有发现衰老细胞死亡或坏死。

　　DNA 损伤诱导的衰老坏死是由过度的细胞内 ROS 生成引起的，这会损害 DNA 修复和细胞信号传导。在这方面，在阿昔替尼（axitinib）敏感的 U87 和 T98 细胞中观察到 ROS 生成的时间依赖性增加。用抗氧化剂NAC预处理，导致β-gal+PI+细胞的百分比降低。相反，在 U251 胶质瘤细胞中，阿昔替尼无法触发 ROS 信号，使药物处理的细胞对过早衰老和细胞死亡具有抵抗力。同样，用阿昔替尼治疗 RCC 细胞和胃癌细胞会导致 G2 期细胞周期停滞，并诱导 ROS 依赖性 SA-β-半乳糖苷酶阳性衰老表型。

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