克唑替尼(Crizotinib)诱导自噬的途径

　　自噬是真核生物中进化上保守的生存途径，在化疗或靶向治疗后经常在癌细胞中上调。因此，自噬的诱导已成为一种耐药机制。在这项研究中，我们发现克唑替尼（Crizotinib）通过抑制 STAT3 在肺癌细胞中诱导高水平的自噬。野生型或组成型激活的 STAT3 的异位表达显着抑制了克唑替尼对自噬的影响。有趣的是，克唑替尼介导的 STAT3 抑制是逐步进行的。它首先抑制细胞质 STAT3，导致 EIF2A 磷酸化，然后抑制核 STAT3，导致 BCL-2 下调。在药物抑制剂或针对 Beclin-1 的 shRNA 抑制自噬后，克唑替尼诱导的细胞死亡大大增强。此外，自噬抑制剂 HCQ 显着增强了克唑替尼在小鼠异种移植模型中的抗肿瘤作用。总之，克唑替尼可以通过抑制肺癌细胞中的 STAT3 来诱导细胞保护性自噬。因此，自噬抑制代表了一种提高克唑替尼治疗靶向肺癌患者疗效的有前景的方法。

　　在本研究中，我们探讨了克唑替尼（Crizotinib）是否能够在靶细胞系中诱导自噬，并发现该治疗在敏感的 SPC-A1 细胞以及抗性 A549 细胞中诱导了自噬。克唑替尼治疗也可以在 EML4-ALK 阳性 H2228 细胞中诱导相同的效果。这一观察结果与 Ji 等人的结果一致。我们观察到暴露于克唑替尼后肺癌细胞中 LC3 的脂化和 p62 的降解。免疫荧光还显示，在克唑替尼处理的细胞中，内源性 LC3 点状染色增加。经典的自噬检测方法 TEM 也显示，在用克唑替尼处理的细胞中自噬体显着增加。这些结果提供了强有力的证据，证明克唑替尼在治疗的肺癌细胞中激活自噬。

　　MET扩增存在于肺癌患者的约4％并且与对EGFR抑制获得性抗性以及ALK抑制。异常MET活化癌在肺的子组被认为是司机致癌基因，MET是RTK超家族的经典成员，其介导RAS-ERK-MAPK、PI3K-AKT-MTOR和STAT3通路的激活，所有这些通路都与自噬诱导密切相关。 在本研究中，我们首先发现SPC-A1细胞中MET、AKT、MTOR和STAT3的磷酸化被显着抑制。为了证实克唑替尼对肺癌细胞自噬的诱导是MET抑制的结果，我们使用小干扰RNA特异性靶向MET，并揭示METmRNA的敲低导致MET表达的下调。因此，我们观察到 LC3-I 向 LC3-II 的转变以及 p62 的降解。此外，在 SPC-A1 细胞中 siMET 处理后观察到与溶酶体共定位的 LC3-II 斑点显着增加。添加 HGF 可以逆转克唑替尼诱导的点状 LC3 表达。然而，我们确实注意到，与克唑替尼治疗相比，通过 siRNA 进行的 MET 特异性抑制对自噬相关标志物的诱导作用远没有那么显着。这一观察结果使我们验证了克唑替尼治疗后 5 种其他肺癌细胞系中的 MET 表达和下游信号传导，包括 A549、H1975、Calu-3、HCC827 和 H1650。有趣的是，虽然这些细胞系中总 MET 的表达水平不同，但 MET 磷酸化的基线水平仅在 A549 和 HCC827 细胞中检测到，而在 H1975、Calu-3 或 H1650 细胞中检测不到。然而，在诱导自噬的 3 个细胞系（A549、H1975 和 HCC827）中，p-STAT3 的下调是唯一的共同因素，而 p-MET、p-AKT、p-MTOR 或 p -ERK 不一致。这些发现使我们将精力集中在确定克唑替尼诱导的自噬与 STAT3 通路之间的关系上。

　　在 Ji 等人的研究中，克唑替尼（Crizotinib）通过 ALK 依赖性下调 AKT-MTOR 通路诱导 EML4-ALK 阳性 H3122 细胞发生自噬。原始研究中没有提到治疗是否会改变 STAT3 通路。然而，在我们努力寻找参与克唑替尼治疗的共同信号通路的过程中，STAT3 通路在所有测试的肺癌细胞系中都非常出色。此外，我们还检查了克唑替尼治疗后 H2228 细胞的磷酸化状态，H2228 细胞是一种已确认的 EML4-ALK 阳性肺癌细胞系，并发现 STAT3 的磷酸化水平也被下调。因此我们推测AKT-MTOR通路的抑制可能不是克唑替尼诱导的自噬的主要因素，而是STAT3通路。IL-6，携带野生型和组成型激活的 STAT3 的质粒被用来证实 STAT3 参与克唑替尼诱导的自噬。

　　有趣的是，我们还检查了 STAT3 的上游分子，发现 JAK1、JAK2 和 SRC 都没有参与克唑替尼（Crizotinib）介导的 SPC-A1 细胞中的 STAT3 抑制，这表明克唑替尼可能直接抑制 STAT3。尽管如此，在进一步调查之前，这一假设仍然存在争议。此外，克唑替尼诱导的 STAT3 抑制得到了 Hamedani 等人的研究的支持。这表明克唑替尼通过下调 NPM-ALK 阳性间变性大细胞淋巴瘤中的 STAT3 磷酸化来诱导细胞凋亡。然而，原始工作中并未采用 ALK 的遗传抑制。因此，应谨慎解释研究结果，因为 p-STAT3 的下调可能是 ALK 抑制或直接克唑替尼抑制的结果。

　　研究表明，STAT3 不仅通过自噬相关基因（如 BCL-2）的转录调控抑制自噬，还通过隔离细胞质 EIF2AK2，阻止 EIF2A 的磷酸化。因此，我们检查了克唑替尼处理 48 小时后，SPC-A1 细胞中 BCL-2 的蛋白质水平以及 EIF2AK2 和 EIF2A 的磷酸化。不出所料，克唑替尼（Crizotinib）治疗后BCL-2蛋白水平显着降低，而EIF2A水平升高；然而，p-EIF2AK2 的水平并没有像推测的那样增加，而是减少了。参考Shen等的原文章，我们发现EIF2A和EIF2AK2磷酸化上调的观察不是在同一时间范围内进行的，而是分别在自噬诱导2小时和15小时后记录的。因此，我们在克唑替尼治疗 2 小时或 15 小时后测试了这 2 种蛋白质的表达水平，并获得了非常不同的结果。处理2小时后，EIF2AK2和EIF2A的磷酸化均上调，而BCL-2水平不变。我们还注意到 MTOR 的磷酸化在这个时间范围内没有减少。这表明克唑替尼治疗 2 小时后 LC3 转变所证明的自噬诱导不太可能是由于核 STAT3 对 BCL-2 的转录下调或 MTOR 抑制的丧失，而是细胞质 STAT3 抑制的结果。我们在克唑替尼处理 15 小时后在 SPC-A1、A549 和 HCC827 细胞中再次证实了这一假设并获得了相似的数据。这表明由细胞质 STAT3 抑制引起的 EIF2A 磷酸化增加以及由核 STAT3 抑制介导的 BCL-2 减少可能都有助于诱导自噬，但它们在这些肺癌中发生的时间间隔不同细胞系。还进行了另一个有趣的观察，即 p-EIF2AK2 在自噬诱导的延长后下调。这可能是由于自噬流后期或严重自噬降解的翻译后蛋白质修饰所致，但此前未见报道。这可能表明 p-EIF2AK2 以某种方式与自噬体构建的蛋白质复合物整合或相互作用。然而，这一假设仍需进一步研究。

　　总之，我们得出结论，克唑替尼（Crizotinib）可以通过 STAT3 依赖性机制逐步激活肺癌细胞中的自噬。在克唑替尼诱导的自噬的早期阶段，细胞质 STAT3 抑制导致 EIF2A 磷酸化，随后诱导自噬。在克唑替尼诱导的自噬后期，核 STAT3 抑制导致 BCL-2 下调，从而促进自噬反应延长。药理学或遗传学方法抑制自噬使靶向肺癌细胞对克唑替尼敏感，至少部分是通过促进克唑替尼诱导的细胞凋亡。自噬抑制代表了一种有前景的方法，可以规避靶向肺癌细胞对克唑替尼的内在或获得性耐药。微信扫描下方二维码了解更多：