尼达尼布(nintedanib)对纤维细胞分化和迁移的直接影响

　　尼达尼布（nintedanib）是一种酪氨酸激酶抑制剂，对血小板衍生生长因子受体 (PDGFR)、成纤维细胞生长因子受体 (FGFR) 和血管内皮生长因子受体 (VEGFR) 具有特异性，最近已被批准用于特发性肺纤维化。纤维细胞是骨髓来源的祖细胞，可产生生长因子并促进肺纤维化。然而，尼达尼布对纤维细胞功能的影响仍不清楚。

　　方法

　　从健康志愿者的外周血中分离出人类单核细胞。使用ELISA和Western印迹分析纤维细胞中生长因子及其受体的表达。尼达尼布对纤维细胞刺激肺成纤维细胞的能力的影响在它们的增殖方面进行了检查。还评估了尼达尼布对纤维细胞分化和迁移的直接影响。我们研究了尼达尼布（nintedanib）是否影响了博莱霉素处理的小鼠肺中纤维细胞的积累。

　　结果

　　人纤维细胞产生 PDGF、FGF2 和 VEGF-A。尼达尼布和每种生长因子受体的特异性抑制剂显着抑制由纤维细胞上清液刺激的肺成纤维细胞的增殖。尼达尼布在体外抑制生长因子诱导的纤维细胞的迁移和分化。博莱霉素诱导的肺纤维化模型中的纤维细胞数量因尼达尼布的给药而减少，这与抗纤维化作用有关。

　　结论

　　这些结果支持纤维细胞作为生长因子的生产者和反应者的作用，并表明尼达尼布的抗纤维化作用至少部分是由抑制纤维细胞功能介导的。

　　尼达尼布（nintedanib）是一种酪氨酸激酶抑制剂，最近在世界主要地区被批准用于治疗 IPF 患者。然而，尼达尼布减轻肺纤维化的机制尚未完全阐明。在本研究中，我们检查了尼达尼布对纤维细胞的影响，以提高对尼达尼布抗纤维化作用的理解。尼达尼布在体外抑制纤维细胞的迁移和分化。纤维细胞刺激成纤维细胞增殖的活性也被尼达尼布阻断。此外，尼达尼布治疗显着减少了 BLM 诱导的小鼠肺纤维化模型肺中纤维细胞的积累。

　　纤维细胞是单核细胞衍生的细胞，被认为是间充质祖细胞的一个亚群，表达造血细胞 (CD34)、白细胞 (CD11b、CD13 和 CD45) 和成纤维细胞产物 (胶原蛋白 I 和 III 以及纤连蛋白) 的标志物。纤维细胞与肺纤维化的发病机制有关。由于纤维化的特征是活化成纤维细胞的积累和纤维化细胞外基质蛋白（包括 I 型胶原蛋白）的过度沉积，因此纤维细胞被认为是肺纤维化的重要直接因素。然而，最近的一项研究表明，在 BLM 诱导的肺纤维化模型中，纤维细胞在胶原蛋白生成中的作用可以忽略不计。另一方面，我们发现纤维细胞是一组细胞，可产生各种生长因子，包括 FGF2、PDGF-BB 和 VEGF-A 。这些发现表明，纤维细胞是一个重要的细胞群，负责在尼达尼布靶向的信号通路中产生配体。

　　尼达尼布（nintedanib）是一种有效的酪氨酸激酶抑制剂，针对FGFR，PDGFR，VEGFR。在本研究中，我们使用免疫印迹分析显示纤维细胞表达 FGFR2 和 VEGFR1。我们之前使用 qPCR 和流式细胞术分析证明了 PDGFRα 和 β 的表达；然而，在本研究中，通过免疫印迹分析检测 PDGFRα 和 β 是不够的。这可能是由于用于检测 PDGFR 表达的方法，因为 PDGF 蛋白可能会刺激纤维细胞的迁移。我们还显示成纤维细胞表达 FGFR2 和 PDGFRα 和 β。因此，纤维细胞和成纤维细胞可能是尼达尼布的推定治疗靶细胞。

　　纤维细胞的上清液刺激了成纤维细胞上酪氨酸激酶受体的磷酸化，证实了尼达尼布对这些受体的抑制作用。尽管通过添加纤维细胞的培养上清液，成纤维细胞的PDGFR被磷酸化，但无论是否添加纤维细胞上清液，FGFR都会被磷酸化。此外，虽然观察到尼达尼布对 PDGFR 磷酸化的抑制作用约为 10-100 nM，但对 FGFR 磷酸化的抑制需要 100-1000 nM。这些差异可能是由两个原因造成的。首先，成纤维细胞也产生 FGF2。其次，据报道尼达尼布对 PDGFRα 和 PDGFRβ的 IC50值在 41–58 nM 的范围内，而对 FGFR2的 IC50值为 257 nM。

　　由纤维细胞上清液诱导的成纤维细胞上受体的活化导致它们的增殖。Nintedanib 和 BGJ398（FGFR 抑制剂）在浓度而不是 100 nM 时减弱了这种增殖。尽管伊马替尼（一种 PDGFR 抑制剂）也能抑制成纤维细胞的生长，但它需要大于 1 μM 的浓度。据报道，伊马替尼对 PDGFR的 IC50值在 100 nM 到 380 nM 的范围内。由于使用的细胞类型不同，很难直接比较伊马替尼和尼达尼布，但 IC50本研究认为伊马替尼的价值高于尼达尼布。SU5416 是一种 VEGF 抑制剂，即使使用 1 μM 作为最大浓度，也不会对细胞生长产生抑制作用。由于纤维细胞产生的 VEGF 少于成纤维细胞的产生。FGF 和 PDGF 被认为比 VEGF 更重要，因为它们是由激活成纤维细胞增殖的纤维细胞产生的生长因子。

　　我们还研究了尼达尼布（nintedanib）对单核细胞分化成纤维细胞的影响。在本研究中，不仅尼达尼布观察到了抑制作用，而且 FGFR、PDGFR 和 VEGFR 的特异性抑制剂也观察到了抑制作用。我们还证明了包括 PDGF、FGF 和 VEGF 在内的几种生长因子刺激了纤维细胞的分化。据报道，纤维细胞的分化被纤维化细胞因子如白细胞介素 (IL)-4 和 IL-13 以及 PDGF 增强。然而，尚未研究纤维细胞分化与 FGF/FGFR 或 VEGF/VEGFR 信号通路之间的关系。已显示单核细胞表达 FGFR、PDGFR和 VEGFR，但是在本研究中，通过对单核细胞的免疫印迹没有清楚地检测到生长因子受体。因此，这些生长因子可能在肺纤维化中的纤维细胞分化中起作用。

　　我们发现尼达尼布（nintedanib）抑制了纤维细胞的迁移。在我们之前的研究中，发现 PDGF/PDGFR 轴在体外和体内纤维细胞迁移到纤维化肺中发挥作用。此外，我们证明 FGF 和 VEGF 是本研究中纤维细胞的有效化学引诱剂。因此，尼达尼布被认为通过直接抑制纤维细胞的分化和迁移来预防肺纤维化。然而，尼达尼布不能抑制由 FGF2 刺激的纤维细胞的迁移。如上所述，认为这是因为 IC50nintedanib 对 FGFR 的价值很高。尼达尼布在体外实验中的作用也在体内实验中得到证实。尼达尼布的给药显着减少了用 BLM 治疗诱导肺纤维化的小鼠肺组织中的纤维细胞数量。

　　这项研究的局限性在于，在我们的模型中，很难检查尼达尼布（nintedanib）对纤维化阶段纤维细胞诱导的影响。因为在小鼠博来霉素诱导的肺纤维化模型中，诱导到肺的纤维细胞数量从第 7 天开始增加，但在第 21 天急剧减少。因此，为了规避这个问题，对接受尼达尼布的患者肺组织的分析可能会提供更多信息，以了解未来研究中对纤维细胞募集的影响。

　　总之，本研究清楚地证明了尼达尼布的新型抗纤维化活性。尼达尼布直接抑制纤维细胞的迁移和分化。此外，尼达尼布阻断了由纤维细胞产生的介质刺激的促纤维化生长因子的受体。微信扫描下方二维码了解更多：