维加特/尼达尼布抗纤维化作用的新机制

　　特发性肺纤维化 (IPF) 是一种病程持续且治疗选择有限的疾病。尼达尼布 (维加特) 是一种多酪氨酸激酶抑制剂，最近被美国食品和药物管理局批准用于治疗 IPF。然而，尼达尼布的确切抗纤维化作用机制尚不清楚。因此，我们研究了尼达尼布对从 IPF 患者肺部分离的成纤维细胞的影响。通过蛋白质免疫印迹和实时 PCR 评估促纤维化标志物的蛋白质和基因表达。自噬标志物和信号事件通过生化分析、蛋白质免疫印迹、显微镜检查和免疫荧光染色进行监测。自噬效应蛋白的沉默是通过小干扰 RNA 实现的。尼达尼布下调细胞外基质 (ECM) 蛋白、纤连蛋白和胶原蛋白 1a1 的蛋白质和 mRNA 表达，同时抑制转化生长因子 (TGF)-β1 诱导的肌成纤维细胞分化。尼达尼布还诱导 beclin-1 依赖性、ATG7 非依赖性自噬。尼达尼布的 ECM 抑制作用不是由典型自噬介导的。尼达尼布抑制 TGF-β 信号传导的早期事件，特别是 II 型 TGF-β 受体的酪氨酸磷酸化、SMAD3 的激活和 p38 丝裂原活化蛋白激酶。尼达尼布下调 ECM 的产生并诱导 IPF 成纤维细胞中的非经典自噬，同时抑制 TGF-β 信号传导。

　　根据 III 期临床试验，尼达尼布 (维加特) 最近已被 FDA 批准用于治疗 IPF，该试验证明疾病进展延迟（基于 FVC 下降速度较慢）和首次急性加重时间延长。已知尼达尼布是一种多酪氨酸激酶抑制剂 (TKI)，其靶向 PDGF、VEGF 和 FGF 的受体激酶。然而，尼达尼布推定的抗纤维化作用尚未明确定义。例如，虽然 PDGF 受体 (PDGFR) 通路与纤维化动物模型有关，但我们的小组已经表明抑制成纤维细胞增殖的策略（通过 TKI）不足以介导晚期的抗纤维化作用。组织损伤修复。事实上，一项针对 IPF 的伊马替尼（抑制 PDGFR）的临床试验未能显示出临床益处。在这项研究中，我们表明，调节成纤维细胞（纤维化中的关键效应细胞）的促纤维化作用的多种协调机制可能解释了这种药物在 IPF 中的临床益处；尼达尼布的这些作用包括抑制 TGF-β 受体信号传导，抑制纤连蛋白和胶原蛋白 1a1 mRNA 的表达，而不依赖于 TGF-β 信号传导，以及诱导非典型自噬。

　　TGF-β 信号传导已被证明是涉及多个器官系统的纤维化的核心，包括肺；此外，IPF 患者肺中的 TGF-β1 上调。据我们所知，我们的研究首次表明尼达尼布 (维加特) 抑制早期 TGF-β 受体激活的 SMAD3 和 p38 MAPK 磷酸化。我们的数据也印证了先前的调查结果，即尼达尼布抑制TGF-β1介导的成纤维细胞至肌成纤维细胞分化。TGF-β 受体是 I 型 (TβRI) 和 II 型 (TβRII) 受体的异源二聚体；配体与 TβRII 结合，激活 TβRI 丝氨酸-苏氨酸激酶，进而磷酸化受体激活的 SMAD 中的丝氨酸残基，主要是 SMAD2 和 SMAD3。最近的研究表明，TβRII 亚基细胞质尾部酪氨酸残基的磷酸化可调节受体的激活及其下游效应。特别是，已知非受体酪氨酸激酶Src磷酸化这些残基之一 (Y284)，这是下游 p38 MAPK 信号传导所必需的。值得注意的是，尼达尼布已知可抑制属于Src家族的非受体酪氨酸激酶，其抗纤维化作用的意义尚不清楚。目前尚不清楚尼达尼布抑制 SMAD3 和 p38 MAPK 磷酸化的作用（在我们的研究中）是由于对 TβRII 的直接作用还是包括通过抑制非受体Src激酶产生的间接作用（图 E5A 和 E5B）。我们小组最近发表了Src家族激酶的强效抑制剂 saracatinib (AZD0530)，在体外消除了 TGF-β1 介导的肌成纤维细胞分化和博莱霉素诱导的小鼠纤维化。这些研究和我们目前的数据表明，尼达尼布有可能通过其对 TβRII 和/或非受体酪氨酸激酶的直接作用来介导重要的体内抗纤维化作用。

　　我们的研究揭示了尼达尼布 (维加特) 在促进成纤维细胞自噬方面的新作用。自噬是一种适应性应激反应，据报道在 IPF 中受损。然而，尚不清楚自噬缺陷是 IPF 的致病因素还是伴随衰老的附带现象。我们发现尼达尼布诱导的自噬不依赖于 ATG7 且依赖于 beclin-1，因此代表了一种非常规途径。几种 TKI，其中大部分用于癌症治疗，已被证明可诱导自噬；这些 TKI 诱导自噬的机制包括阻断生长因子的信号传导和对自噬途径的直接作用。ECM 蛋白自噬清除的减少可能导致它们的积累，从而导致纤维化；相反，可能预测自噬增强剂有助于解决纤维化。然而，我们的数据表明，经典自噬不是尼达尼布处理的成纤维细胞中 ECM 蛋白减少的主要机制。自噬可能代表对尼达尼布阻断生长因子信号传导的适应性细胞存活反应。如果是这种情况，尼达尼布与自噬抑制剂（如氯喹）的联合治疗可能会通过将自噬命运从细胞存活转变为细胞死亡来提供治疗优势。这种阻断自噬细胞对靶向治疗的应激反应的范例已被提议作为一种新的癌症治疗方法。

　　总之，我们报告说尼达尼布 (维加特) ，一种最近被 FDA 批准用于 IPF 的 TKI，抑制 TGF-β 信号传导，下调 ECM 基因/蛋白质表达，并促进非经典自噬。重要的是，我们发现尼达尼布的自噬促进作用并不能解释其对 IPF 肺成纤维细胞的推定抗纤维化作用。相反，这项研究表明，将抗纤维化 TKI（如尼达尼布）与自噬抑制相结合的治疗方法可能会增强 TKI 的治疗效果。同样令人感兴趣的是，尼达尼布和另一种新批准的药物吡非尼酮都针对多种途径和过程，这表明这种多靶点方法将是必要的，并且可以进一步优化用于治疗 IPF。微信扫描下方二维码了解更多：