尼达尼布可以进一步探索作为滑膜肉瘤的潜在治疗手段

　　尼达尼布的靶点RTKs在多个肉瘤细胞系中表达

　　尼达尼布是一种小分子抑制剂，靶向肿瘤血管生成中涉及的多种RTKs，如VEGFR、PDGFR和FGFR。它是一种吲哚酮衍生物，已被证明可以阻断RTKs，如低纳摩尔浓度的VEGFR和PDGFR家族，还可以阻断周细胞和内皮细胞中下游的MAPK和AKT信号传导。测试基础表达水平尼达尼布药物目标，我们进行了免疫印迹分析使用9不同肉瘤细胞系属于各种亚型如尤因肉瘤，脂肪肉瘤，恶性周围神经鞘瘤(对于ST8814)，滑膜肉瘤和骨肉瘤。被检测的细胞株表达恶性周围神经鞘肿瘤的PDGFR、FGFR和VEGFR家族，滑膜肉瘤细胞株显示尼达尼布药物靶点最大数量的表达。尼达尼布可以进一步探索作为滑膜肉瘤的潜在治疗手段吗？

　　尼达尼布在表达PDGFR和FGFR的肉瘤细胞系中显示出强大的抗增殖活性和抑制下游信号转导

　　为了测试尼达尼布在多种肉瘤细胞系中的抗增殖作用，我们在增加药物浓度6天后进行了细胞活力测定。尼达尼布处理会抑制细胞增殖，尤其是在同时表达RTKsPDGFR和FGFR家族的细胞系中。MPNST、ST8814以及滑膜肉瘤细胞株(SYO-1，HS-SY-II)在纳米范围内的细胞增殖受到抑制，与Ewing肉瘤细胞株(A673和CHP100)相比。在微摩尔浓度下，脂肉瘤细胞株(DDLS，LS141)和骨肉瘤细胞株SaOS2被观察到具有适度的活性。SYO-1和ST8814细胞系IC50值<1μmol/L，对于HS-SY-II，和LS141细胞系之间IC50值1-2μmol/L，而SaOS2，ddl，A673，和CHP100细胞系IC50值>5-10μmol/L。

　　为了检测尼达尼布对下游信号通路的抑制作用，我们在4个细胞系(根据抗增殖效果选择)中增加尼达尼布的剂量，进行了Westernblot分析。在SYO-1和ST8814细胞系中，增加尼达尼布剂量的治疗可显著抑制p-AKT。在SYO-1细胞株中也观察到p-ERK1/2的抑制，而在ST8814细胞株中未见p-ERK1/2的抑制。这可能部分是由于ST8814细胞系具有较高的基础水平的p-ERK1/2，由于该细胞系NF1(1型神经纤维瘤病)的缺失和Ras活性的增加，p-ERK1/2难以抑制。另一方面，A673和CHP100细胞在尼达尼布处理后p-AKT和p-ERK1/2水平无变化。这与观察结果相关，即即使在微摩尔浓度的药物下，这两种细胞系也没有表现出明显的增殖抑制。

　　为了测试药物治疗是否会抑制不同细胞系的RTKs，我们对上述4个细胞系进行了phospho-RTK蛋白组阵列分析。尼达尼布治疗(在500nmol/L)导致了RTK差别明显对这些目标包括PDGFRα和PDGFRβ测试所有的细胞系包括A673和CHP100。这表明，尽管PDGFRβ被尼达尼布的磷酸化，缺乏抗增殖效果两尤因肉瘤细胞株A673CHP100可能是由于这一事实以外的途径PDGFR如Ins-R和IGF-1R推动细胞增殖。虽然我们能够观察到SYO-1和ST8814细胞系中磷酸化的RYK水平，但它不太可能在驱动肉瘤细胞生长中发挥任何重要作用，尤其是因为它自身缺乏任何催化活性。

　　在表达高水平VEGFR2的SYO-1细胞系中，无论是通过RTK阵列还是通过Westernblot分析，我们都无法检测到任何磷酸化的VEGFR2。AXL是一种特征良好的RTK，已被证实是在gist中伊马替尼耐药的结果。为了检测尼达尼布处理是否诱导AXL，我们进行了Westernblot分析。我们的结果表明，SYO-1细胞缺乏总水平和磷酸化的AXL水平。Westernblot检测显示CHP100细胞株存在AXL受体总量；然而，无论是否用尼达尼布处理细胞，都无法检测到磷酸化的AXL。接下来，我们想测试尼达尼布治疗是否导致非rtks的下调，如SRC家族激酶，一个已知的尼达尼布下游靶点。

　　根据phospho-SRCTyr416Westernblot分析，500尼达尼布处理后并没有激活SRC家族激酶。尼达尼布治疗后SRC总水平未见变化。我们还使用non-RTKproteinprofilerarraykit(R&DSystems)对非rtk磷酸化进行了分析。在SYO-1和CHP100细胞系中，阵列检测到的大部分非rtks包括JNK、GSK3、、c-Jun、PRAS40和HSP60激酶。磷酸化FAK仅在SYO-1细胞系中检测到；然而，尼达尼布治疗后FAK的磷酸化没有明显变化。此外，在两种细胞系中，在SYO-1细胞系中，除了p53磷酸化外，未观察到任何非rtks磷酸化的主要变化。我们无法在非rtk阵列上检测到任何磷酸化的SRC。

　　尼达尼布的抗增殖活性是持续抑制p-AKT和p-ERK1/2的结果

　　确定尼达尼布的抑制作用是由于抑制p-AKT和p-ERK途径相结合，我们测试了MEK抑制剂的功效(MEKi)selumetinib和AKT抑制剂(AKTi)mk-2206单独或组合和抑制效应对尼达尼布和伊马替尼相比，另一个著名的c-kit和PDGFR抑制剂。实验显示，尼达尼布对滑膜肉瘤细胞株SYO-1的抑制作用显著(P<0.01和P<0.05)优于伊马替尼单独或MEKi和AKTi联合。另一方面，CHP100(Ewing肉瘤)细胞株未观察到明显的增殖抑制。在ST8814细胞株中，MEKi和AKTi联合使用对细胞增殖的抑制效果明显优于单独使用尼达尼布。对于A673细胞系，尼达尼布治疗与未对照相比，未导致明显的细胞增殖抑制；然而，MEKi和AKTi联合处理显著抑制了增殖。药物治疗24小时后Westernblot检测通路抑制结果显示，单独或联合AKTi均不能抑制p-ERK1/2。

　　另一方面，尼达尼布处理可显著抑制SYO-1细胞株的p-AKT和p-ERK1/2水平。尼达尼布与MEKi联合处理时，与单独尼达尼布相比，尼达尼布进一步抑制了细胞增殖(P<0.05)，并进一步抑制了P-erk1/2水平。在Ewing肉瘤细胞系A673和CHP100中未观察到下游信号通路的抑制。值得注意的是，当药物治疗3天后测定细胞活力时，尼达尼布与MEKi和AKTi联合治疗对SYO-1细胞系的细胞增殖抑制作用似乎是相似的。然而，在药物暴露6天后进行实验时，与MEKi和AKTi联合使用相比，尼达尼布处理导致细胞增殖进一步受到抑制。

　　尼达尼布的抗增殖活性是PDGFR和FGFR途径联合抑制的结果

　　为了验证尼达尼布的抑制作用是否是通过抑制PDGFR和/或FGFR途径介导的，我们在尼达尼布或pan-FGFR抑制剂PD173074治疗后进行了细胞增殖实验和Westernblot分析。与DMSO对照相比，使用pan-FGFR抑制剂PD173074抑制细胞增殖的效果显著(P<0.001)。然而，尼达尼布对细胞增殖的抑制效果明显优于PD173074(P<0.01)，尤其是在500和1000nmol/L浓度下。Westernblot分析显示，经PD173074处理后，SYO-1细胞株的p-ERK1/2信号明显受到抑制；但是，没有减少p-AKT信号观察。尼达尼布治疗，另一方面，显示显著减少p-AKT以及p-ERK1/2信号在500nmol/L浓度。结果尼达尼布和pan-FGFR抑制SYO-1细胞系强烈建议的角色结合抑制PDGFR和FGFR下调p-AKT信号与抑制FGFR活动仅下调p-ERK1/2信号。无显著抑制细胞增殖或任何减少下游p-AKT信号在CHP100细胞系。有趣的是，基底CHP100细胞系的p-ERK1/2水平较低而SYO-1细胞系后，只显示适度减少尼达尼布或PD173074治疗。

　　另一种多靶点激酶Pazopanib最近被批准用于治疗软组织肉瘤。为了测试在SYO-1中尼达尼布治疗是否优于pazopanib治疗，我们进行了细胞活力测定和Westernblot分析来比较它们的疗效。尼达尼布对SYO-1细胞系的抑制作用明显优于pazopanib(P<0.05)。正如前面看到的，尼达尼布治疗(在1000nmol/L)导致抑制p-AKT以及p-ERK1/2，而pazopanib治疗(在1000nmol/L)的p-AKT差别显示对这些信号的差别但没有表现出任何对这些p-ERK1/2信号强烈暗示尼达尼布待遇优越的滑膜肉瘤设置。此外，最近有研究表明，与其他同类竞争分子如舒尼替尼、pazopanib和vandetanib相比，尼达尼布对三重血管激酶面板具有更强的抑制作用。

　　为了进一步证实PDGFR和FGFR在促进细胞增殖中的作用，我们进行了sirna介导的SYO-1细胞系细胞增殖分析。与对照siRNA相比，siRNA介导的单个RTKs(PDGFR、FGFR1和FGFR2)敲低可显著抑制细胞增殖(P<0.01)。然而，与单或双sirna介导的RTK沉默相比，PDGFRinhibitor、FGFR1和FGFR2的联合抑制(因此，模拟尼达尼布治疗)可进一步抑制细胞增殖(P<0.05)。Westernblot显示，siRNA处理导致RTKs显著下调。在使用泛fgfr抑制剂PD173074时，sirna介导的FGFR1和FGFR2敲低导致pERK1/2下调，而只有PDGFRfr和FGFR1以及FGFR2同时敲低才导致p-AKT信号下调。

　　与伊马替尼相比，尼达尼布在SYO-1异种移植模型体内显著抑制肿瘤生长

　　为了检验尼达尼布在体内的治疗效果，我们采用SYO-1异种移植模型进行了小鼠异种移植实验。我们比较了早期体外测试的尼达尼布对伊马替尼的体内疗效。与对照剂相比，伊马替尼和尼达尼布治疗均显著抑制(P<0.05和P<0.005)肿瘤生长。但尼达尼布治疗后肿瘤抑制效果明显优于伊马替尼(P<0.01)。对尼达尼布治疗3周后获得的组织标本进行Westernblot分析显示，与伊马替尼治疗相比，尼达尼布可以诱导裂解的PARP(凋亡的替代标记物)，并能更好地抑制FGFR、p-AKT和p-ERK1/2的磷酸化。

　　因为尼达尼布除了阻断PDGFR和FGFR外，还阻断了VEGFR，所以我们通过CD31免疫组化检测了尼达尼布治疗对肿瘤血管系统的影响。根据之前的报道，尼达尼布治疗可抑制肿瘤血管密度，与载体控制相比，褐色免疫组化染色完全消失。另一方面，伊马替尼治疗未显示CD31染色减少。SYO-1异种移植物的体内肿瘤生长数据、Westernblot分析和免疫组化结果证实了我们的体外发现，尼达尼布可以进一步探索作为滑膜肉瘤的潜在治疗手段。尼达尼布一盒多少钱？一般的患者一个月需要吃几盒呢？花费多吗？如果是服用原研药估计没几个患者可以承担的起，还好有了仿制药，怎么够买仿制药呢？快来咨询康安途吧。