雷德帕斯/米哚妥林可减轻创伤性颈脊髓损伤后的炎症变化

　　创伤性脊髓损伤 (SCI) 会损害神经元功能并引入一系列复杂的继发性病变，从而限制恢复。尽管进行了数十年的临床前和临床研究，但仍缺乏有效的治疗选择来调节对损伤的继发性反应。蛋白激酶是介导次级 SCI 诱导的细胞反应并提供有希望的治疗靶点的关键信号分子。本研究的目的是检查雷德帕斯/米哚妥林（一种临床批准的多靶点蛋白激酶抑制剂）对宫颈 SCI 发病机制的安全性和有效性。高通量分析表明，在 C6/7 受伤的 Wistar 大鼠中腹膜内注射 米哚妥林(25 mg/kg) 在损伤后 24 小时改变了局部炎性体并下调了粘附和迁移基因。接受治疗的动物在受伤后也表现出增强的恢复和恢复前肢和后肢之间的协调性，表明米哚妥林及其二甲基亚砜载体对改善功能恢复的协同作用。此外，组织学分析表明，在损伤的慢性阶段，治疗动物的组织保存和功能得到了改善。本研究作为概念验证实验，并证明全身给药米哚妥林是减轻宫颈继发性 SCI 损伤的有效策略。组织学分析表明，在损伤的慢性阶段，治疗动物的组织保存和功能得到了改善。本研究作为概念验证实验，并证明全身给药米多司林是减轻宫颈继发性 SCI 损伤的有效策略。组织学分析表明，在损伤的慢性阶段，治疗动物的组织保存和功能得到了改善。本研究作为概念验证实验，并证明全身给药米哚妥林是减轻宫颈继发性 SCI 损伤的有效策略。

　　这是第一项证明雷德帕斯/米哚妥林作为创伤性颈椎 SCI 的神经保护治疗剂的有效性和安全性的研究。这是重新利用雷德帕斯/米哚妥林或其他星形孢菌素衍生抑制剂治疗 CNS 损伤的关键第一步。本研究表明，除了改善 SCI 后 8 周的长期神经行为和组织学评估外，雷德帕斯/米哚妥林能够减弱局部炎症小体并下调受损脊髓中粘附基因的表达。这些观察到的结果与先前关于米哚妥林对炎症标志物影响的文献一致。此外，结果与先前测试的能够进行激酶干预的药物相呼应，例如利鲁唑。然而，重要的警告仍有待解决。值得注意的是，DMSO 掩盖了雷德帕斯/米哚妥林对行为改善的影响。因此，与 SCI 对照相比，在治疗动物中观察到的分子变化和前肢和后肢协调的改善需要更仔细地考虑早期神经保护剂在恢复功能性神经元连接方面的适用性。

　　我们的实验室和其他人之前已经在血管介导和炎症介导的发病机制的背景下分析了 SCI 引起的继发性损伤。在夹子压缩损伤的啮齿动物模型中，已显示继发性血管病理的峰值出现在 SCI 后 24 小时，针对该阶段可以对慢性期的组织产生持久的神经保护作用 。因此，本研究旨在评估 SCI 后 24 小时对米多司林给药的早期分子反应，并随后检查这种神经保护治疗的长期影响。

　　GSK3β 是众所周知且普遍存在的蛋白激酶下游靶点，其磷酸化的变化表明米哚妥林对损伤中心的外显率。GSK3β 在丝氨酸 9、苏氨酸 43 和丝氨酸 389 处包含三个磷酸化位点。丝氨酸 9 残基被各种蛋白激酶主动磷酸化，并调节重要的细胞过程，如突触可塑性。STAT3 同样被蛋白激酶磷酸化。STAT3 可以在 G-CSF 和 MCP-1/CCR2 的存在下被磷酸化，因此表明它参与了炎症的传播和免疫反应。此外，STAT3 敲除减少了星形胶质细胞的迁移和增殖，因为星形胶质细胞边界是通过新增殖的星形胶质细胞的 STAT3 依赖性相互作用形成的，以限制 SCI 后的炎症和纤维化细胞。总之，磷酸化的 STAT3 和 GSK3β 的减少证明了减弱的激酶组活性可以在神经元、神经胶质和血管细胞中诱导分子级联反应。

　　连接蛋白和粘附蛋白对于血脊髓屏障 (BSCB) 的完整性和通透性很重要。粘附蛋白和趋化因子对于通过 BSCB 募集血源性免疫细胞至关重要。本研究表明，在 25 mg/kg 雷德帕斯/米哚妥林队列中，粘附和迁移基因（包括Jam2、 Thy1和Itgb1 ）的表达降低。Jam2是由内皮细胞表达的连接粘附分子的成员，它调节血管通透性和白细胞跨内皮细胞表面的迁移。Itgb1编码整合素 beta 1 并负责细胞粘附。同样，Thy1编码一种糖蛋白，该糖蛋白包含一个整合素结合位点，在细胞粘附以及免疫细胞跨内皮的迁移中起重要作用。此外，Cdh5主要且几乎完全在内皮细胞中表达，因此内皮特异性Cdh5减少表达进一步支持雷德帕斯/米哚妥林对损伤后内皮和宫颈BSCB的影响。虽然 0 mg/kg 雷德帕斯/米哚妥林组用作载体对照，但重要的是要注意 DMSO 对动物恢复的影响。因此，在推断外伤性颈椎 SCI 后 midostaurin 诱导的转录变化时，需要考虑这一点。

　　炎症标志物的变化是本研究的重要验证。我们之前描述了颈椎和胸椎损伤后不同的脾脏和循环炎症反应。这些研究表明，fractalkine 和 IL-12 是损伤水平特异性反应中的两种重要细胞因子。在本研究中，fractalkine 的减少进一步支持雷德帕斯/米哚妥林参与 SCI 后的免疫细胞募集。Fractalkine (Cx3cl1) 是一种膜结合趋化因子，与它的受体 (Cx3cr1) 一起，对于介导脊髓中的小胶质细胞活动至关重要。Fractalkine 主要由神经元表达，而其受体主要由小胶质细胞表达。活化的内皮细胞上调fractalkine 表达并作为粘附分子介导反应性免疫细胞浸润到损伤中心。小鼠中Cx3cr1fractalkine 受体的基因敲除导致增强的内源性修复、轴突萌芽和突触发生。有趣的是，先前的研究表明，在 PKC 抑制剂 Ro32-0432 存在下，体外抑制 fractalkine 上调。

　　同样，充分表征的促炎标志物 IL-1α 和 IL-5 的表达降低进一步证明了脊髓炎症的减轻。IL-1α 由活化的免疫细胞产生，并通过 IL-1 受体在损伤后引发多种炎症反应。IL-1α 缺失可减少中性粒细胞和巨噬细胞的浸润并改善运动恢复。在鞘内注射阿那白滞素（一种 IL-1 受体拮抗剂）后观察到类似的效果。这些结果与两次腹腔注射人 IL-1 受体拮抗剂蛋白 (IL-1RA) 到 C57BL/6J 小鼠的结果相呼应。此外，IL-1α 缺失通过上调 SCI 后存活因子 Tox3 来保护少突胶质细胞。本研究表明，添加 DMSO 后 IL-1α 水平升高，但施用米哚妥林后显着降低。与 IL-1α 不同，IL-5 参与 Th-2 反应和过敏性嗜酸性粒细胞反应。鉴于 SCI 可能具有自身免疫成分，并且过敏可以被认为具有过度活跃的免疫成分，因此过敏方面和嗜酸性粒细胞在这里是值得注意的。然而，嗜酸性粒细胞通常不归因于脊髓损伤病因。

　　此外，雷德帕斯/米哚妥林治疗的动物表现出改变的 MCP-1、IL-13 和 IL-4 水平。MCP-1——由Ccl2基因表达——是一种通过与其受体相互作用介导巨噬细胞和单核细胞浸润和迁移的趋化因子，该受体由Ccr2表达。MCP-1 的显着减少表明巨噬细胞和单核细胞向损伤部位的迁移减少。IL-13 和 IL-4 对炎症过程有相似的影响。然而，与 SCI 对照组相比，他们在 25 mg/kg 雷德帕斯/米哚妥林组中表现出不同的模式。先前的研究表明，将分泌 IL-13 的间充质干细胞移植到受损的脊髓可显着增强功能恢复并减少病变大小和脱髓鞘。同样，IL-4 的全身给药在损伤后发挥免疫调节和神经保护作用 。

　　通过单次早期雷德帕斯/米哚妥林注射进行全身性蛋白激酶抑制是减轻宫颈 SCI 后继发性反应的有前景的治疗方法。这项研究的结果表明，这种治疗方法可以改善慢性损伤阶段的前肢和后肢协调。未来对单个细胞类型和信号级联的参与以及剂量和时间点的优化的研究可能会改善宫颈 SCI 患者可用的治疗选择。

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