吉非替尼(Gefitinib)对髓母细胞瘤细胞的抗肿瘤作用

　　在三种髓母细胞瘤 (MB) 细胞系（D283、D341、Daoy）、一种幕上原始神经外胚层肿瘤细胞系 (PFSK) 和四种 MB 中评估了表皮生长因子受体 (EGFR) 抑制剂吉非替尼（Gefitinib）对细胞生长和信号传导的影响初级文化。细胞系显示出 EGFR 和人表皮受体 2 (HER2) 的不同表达，在 HER2 过表达的 D341 和 D283 细胞中具有高水平的组成型激活的 HER2。吉非替尼的敏感性因线而异，并且与 HER 受体的表达或受体基线激活无关。吉非替尼诱导 G0/G1在所有细胞系中均停滞，而细胞凋亡仅在 D283 和 D341 细胞中呈剂量依赖性诱导。在 Daoy 和 D341 系中研究了对吉非替尼的分子反应，显示出更高（半数最大抑制浓度 [IC50]，3.8 μM）和更低（IC50, 6.6 μM) 对试剂的敏感性，分别。吉非替尼抑制两种细胞系中的组成型和 EGF 触发的 EGFR 磷酸化，但对 D341 细胞中 HER2 的组成型激活无效。磷酸化 AKT 抑制与磷酸化 EGFR 相似，表明存在自分泌吉非替尼敏感的 EGFR/AKT 通路。总体而言，EGF 依赖性信号传导对 D341 细胞中的配体刺激和吉非替尼抑制反应较弱，这与该细胞系对吉非替尼抗增殖作用的敏感性较低有关。在体内，每天 150 mg/kg 的吉非替尼处理的 D341 和 Daoy 异种移植物的生长被抑制了大约 50%。在 Daoy 细胞中异位过度表达的 HER2 显着增加了对吉非替尼体内抗肿瘤作用的敏感性（肿瘤体积抑制 = 78%）。

　　EGFR-TK 抑制剂吉非替尼（Gefitinib）目前正用于针对多种肿瘤的临床试验，包括肺癌、前列腺癌和乳腺癌。吉非替尼是否可能具有在一个MB的治疗潜力，我们研究了在体外和体内人MB细胞系增殖的抑制剂的效果。

　　使用的 MB 细胞系和原代培养物表达了不同水平的 EGFR 和 HER2。在 D341 和 Daoy 细胞中均检测到 pEGFR，而在 D283 和 D341 中 pHER2 的表达水平最高，这与在 HER2 过表达细胞系中报道的通过同源二聚化的组成型激活一致。在检查的 HER 配体中，只有 EGF、AREG 和 NRG1 在所有细胞系中表达，尽管水平不同。对吉非替尼的敏感性因线而异，并且与 HER 受体和配体的表达或受体的激活状态无关。吉非替尼生长抑制作用与细胞 EGFR 表达的相关性是有争议的。然而，我们在 MB 细胞中的结果与在不同肿瘤（包括乳腺、肺和膀胱）中进行的许多其他临床前研究一致。

　　吉非替尼（Gefitinib）对多种来源的恶性细胞的作用被描述为主要是细胞抑制作用，在较高剂量时发生细胞凋亡。在我们所有的细胞系中，IC70值的吉非替尼导致细胞保留在 G0期，S 期群体急剧减少，但 G2M 分数没有变化或变化很小.仅在 D283 和 D341 细胞系中，细胞凋亡以剂量依赖性方式增加。我们观察到的细胞周期扰动与之前的出版物一致，这些出版物将吉非替尼的影响表征为主要是由于 G0停滞和 G/S 相变受损。在 HER 信号的背景下，HER2 过表达似乎通过下调促凋亡蛋白和上调存活因子来保护肿瘤细胞免于死亡。一致地，通过包括吉非替尼在内的 TK 抑制剂阻断 EGFR/HER2 信号传导，导致 HER2 过度表达的乳腺癌细胞中促/抗凋亡蛋白的协同调节，与诱导凋亡相关。然而，虽然吉非替尼诱导的细胞凋亡仅在两种过度表达 HER2 的 MB 细胞系中是相关现象，但不太可能涉及 HER2 途径，因为吉非替尼不能抑制 D341 和 D283 细胞中 HER2 的磷酸化（数据未显示）。或者，p53 状态可能决定 MB 细胞对吉非替尼诱导的细胞凋亡的易感性，因为 D283 和 D341 细胞都显示野生型 p53，而 Daoy 细胞含有突变型 p53。事实上，最近的一项研究表明，异位表达的 p53 通过上调 Fas，增强了吉非替尼在 p53 缺失的非小细胞肺癌中的生长抑制和细胞凋亡，我们发现吉非替尼在 D283 和 D341 细胞中诱导了 p53 的调节，但不在 Daoy 单元格中（数据未显示）。

　　除了 EGFR 外，还表达 HER2 的肿瘤细胞系在体外和体内对吉非替尼（Gefitinib）的敏感性增加，这很可能是因为吉非替尼能够破坏作为致癌单位的 EGFR/HER2 异二聚体。在 MB 中，HER2 上调前转移基因的转录，促进细胞增殖，并导致较差的临床结果。虽然吉非替尼主要针对 EGFR，但它通过不同的 HER 受体影响信号转导。因此，过表达 HER2 的 MB 可能是吉非替尼抗肿瘤分子治疗的潜在靶点。我们发现 MB 细胞系作为一个整体，对吉非替尼的反应性和 HER2 过表达之间没有相关性，这可能是因为高度多样化的遗传背景。因此，为了进一步解决 HER2 是否可能调节 MB 中对吉非替尼的反应，我们比较了异位过表达 HER2 的同基因 Daoy 细胞。在体外，HER2-转染的克隆系对吉非替尼表现出与野生型细胞相似的敏感性，而在体内观察到抗肿瘤活性的显着改善。我们的体外和体内结果之间的差异表明，吉非替尼可能比肿瘤细胞本身更能影响促进癌症生长的宿主依赖性过程。一个这样的过程可能是血管生成，因为据报道吉非替尼剂量依赖性地抑制血管生成因子的产生，例如 TGFα、碱性成纤维细胞生长因子和血管内皮生长因子 (VEGF)。有趣的是，HER2 与 VEGF 的调节有关，过表达 HER2 的乳腺肿瘤往往比其他乳腺肿瘤更具血管生成性。HER2 过度表达的 D341 系，其特征是更具侵略性的表型，对吉非替尼的反应与 Daoy 系一样，间接证据表明 HER2 可能使细胞对体内的吉非替尼抗肿瘤活性敏感。抑制内源性过度表达 HER2 的细胞中的 HER2 表达可能有助于进一步确定 HER2 在调节 MB 中吉非替尼敏感性中的作用。

　　总之，我们的数据表明吉非替尼（Gefitinib）能够在体外和体内抑制 MB 细胞的生长。在 MB 细胞系中未发现吉非替尼反应性的分子相关性，尽管在相同遗传背景下的 HER2 过表达显着增加了体内对吉非替尼的敏感性。这些数据为吉非替尼在 MB 治疗中的治疗用途提供了实验支持；然而，在 MB 中鉴定对吉非替尼敏感的靶标可能有助于前瞻性地鉴定最有可能对吉非替尼治疗产生反应的肿瘤细胞。微信扫描下方二维码了解更多：