C797S突变是奥希替尼筛选中出现的主要耐药机制

　　一线EGFR-TKI耐药机制比较

　　ENU表示诱变筛选之前，我们选择了克隆Ba/F3细胞窝藏EGFR-del19或L858REGFR-TKIs作为评估高度敏感的筛查。从ENU表示诱变的主要耐药机制从吉非替尼筛查发现+T790M突变，紧随其后的是+野生型(没有额外的表皮生长因子受体的突变)，del19L858R，不管吉非替尼的浓度(无花果。1a和1B)。相比之下，C797S突变是奥希替尼筛选中出现的主要耐药机制——超过50%的del19和约40%的L858R。较高浓度的奥希替尼(600或1200nmol/L)的C797S突变很少，而吉非替尼(gefitinib)的T790M突变在整个浓度中均可观察到。

　　使用C797S表达激活突变的Ba/F3细胞进行细胞活力测定，结果显示对奥希替尼高抗性，对第一代EGFR-TKI处理高敏感性，对第二代EGFR-TKIs(afatinib和dacomitinib)处理中等敏感性。奥希替尼、gefitinib和afatinib对表达C797S/del19的Ba/F3抑制50%(IC50)值的浓度分别为348.9nmol/L、2.9nmol/L和2.3nmol/L。同样使用表达激活突变的Ba/F3细胞，使用T790M，对奥希替尼有明显的敏感性，对第一代处理有明显的耐药性，对第二代处理有中等敏感性。表达T790M/del19的奥希替尼、gefitinib、afatinib对Ba/F3的IC50值分别为4.3nmol/L、4238nmol/L、73.9nmol/L。

　　这些结果表明，由于T790M激活突变是对第一代和第二代EGFR-TKI耐药的相关原因，因此C797S激活突变应该对第三代EGFR-TKI产生耐药，并可通过第一代治疗加以克服。一些病例报告显示，奥希替尼耐药的患者使用吉非替尼可获得临床疗效。

　　在我们的ENU诱变中，吉非替尼和奥希替尼的组合没有引入显示耐药性的额外突变。与单药筛选相比，联合治疗的耐药克隆数量要少得多，这表明这种联合治疗在未来可能成为一种有希望的一线治疗选择。

　　T854A突变介导了C797S/激活突变引起的阿法替尼耐药

　　根据一线奥希替尼处理后C797S出现的结果，我们使用表达激活突变的Ba/F3细胞进行了另一次ENU诱变筛选。另外的T790M(位于cis)突变是C797S对吉非替尼激活突变的主要机制。T854A突变(位于cis)已经被报告为一个较小的抗耐药突变吉非替尼或埃罗替尼，被发现在afatinib放映的10%，而40%到60%的耐火材料+T790M克隆，导致multi-TKI-resistant三突变体，可以克服由brigatinibanti-EGFR抗体如前所述。

　　获得的克隆与T854A/C797S/activating-mutation显示中间电阻第一代和第二代TKIs和重大敏感brigatinib(95.1nmol/L，72.5nmol/L和27.1nmol/L(IC50与T854A/C797S/Ba/F3细胞activating-mutation吉非替尼、afatinib、brigatinib)。Westernblotting证实brigatinib抑制EGFR磷酸化及下游信号通路。虽然afatinib抑制T854A/C797Sactivating-mutationbrigatinib类似的浓度，报告的afatinib血浆浓度大约是50nmol/L60nmol/L，表明100nmol/Lafatinib通常不能在临床环境中实现，而最大浓度的brigatinib人体被报道为2485.9nmol/L(补充无花果。3b和c)。

　　C797S/L858R筛选的afatinib也只获得了一个克隆，L792H突变(位于cis)。这种突变未被报道与阿法替尼耐药有关；然而，Chenetal.19报道其为奥希替尼耐药，Kobayashietal.37报道其为L792F突变。细胞活力测定和Westernblotting显示，该新突变L792H/C797S/L858R不仅介导对afatinib和奥希替尼的耐药，也介导对brigatinib的耐药。这与T854A/C797S突变相反。与其他抑制剂相比，吉非替尼的疗效中等，在细胞活力测定中IC50值为101.3nmol/L，在Westernblotting中抑制下游磷酸化为100nmol/L。

　　为了进一步证实T854A的耐药性，我们生成了表达T854A/激活突变和T854A/C797S/激活突变的Ba/F3细胞。T854A/激活突变显示对阿法替尼和奥希替尼保持敏感性，对吉非替尼具有中等抗性，IC50为50nmol/L至60nmol/L，在细胞活力测定中对brigatinib具有中等敏感性。Westernblotting检测显示TKIs对EGFR磷酸化和下游通路的抑制与细胞活力测定结果相符。

　　在临床环境中，T854A/激活突变可能不是主要问题，因为它对阿法替尼或奥希替尼具有易感性。T854A/C797S/激活突变对奥希替尼高度难治，对吉非替尼、阿法替尼和brigatinib中度耐药，细胞活力测定IC50值约为50nmol/L。L858R的T854A/C797S/激活突变的敏感性低于del19。EGFR磷酸化的抑制和下游信号的西方墨点法评估T854A/C797S/activating-mutation表达Ba/F3细胞治疗表示药物与细胞生存能力分析结果表明brigatinib更强有力的抑制剂对T854A/C797Sactivating-mutation比临床上可用EGFR-TKIs。

　　目前，EGFR激活突变患者的初始治疗选择是第一代和第二代EGFR-tkis-吉非替尼、埃罗替尼或阿法替尼，主要由于T790M在大约1年内出现突变而不可避免地失去疗效。一线奥希替尼批准之后，除了主要的C797S/T790M突变外，还产生了T854A/C797S、L792H/C797S三种耐药突变。相比之下，吉非替尼筛选得到的抗性克隆只有C797S/T790M。

　　C797S/T790M临床上称为新兴从T790M/activating-mutation奥希替尼抗性机制，观察在我们ENU表示诱变筛选。不同的耐药机制的出现可能导致困难或复杂的治疗策略，表明第一代EGFR-TKI疗法更preferablein二线C797S/activating-mutation比第二代。C797S突变中断EGFRafatinib的共价结合，作为奥希替尼观察到，导致C797S/activating-mutation的IC50值接近的可实现的血浆浓度afatinib(48nmol/L-62nmol/L)，这是不同于吉非替尼的IC50值几乎是常数无论C797S的存在；这可能有助于在阿法替尼选择中看到的多样性。奥希替尼多少钱一盒？可以在国内的药店买到吗？详情请扫码咨询：